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宫颈甲基化检测时怎么做的

来源:敬善基因研究中心 400-188-9770

大家都知道现在利用宫颈甲基化检测的能够直接检测出宫颈细胞基因的甲基化程度,从而判断被检测者当前的宫颈状态。那么这一切究竟时怎么检测的呢,就让敬善基因来为您介绍吧!
 
DNA甲基化研究是表观遗传学的重要内容,真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶,即在DNA甲基化转移酶的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达,去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。这种DNA修饰的方式在不改变基因序列前提下实现对基因表达的调控,在脊椎动物的胚胎发育过程中起着重要的调控作用,参与多种疾病包括各种肿瘤的发病机理,是目前表观遗传学研究的热点。
基因甲基化检测
 
主要技术原理
 
利用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,则未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而发生甲基化的胞嘧啶不变。根据某一待测位点或者调查的某一区域序列设计引物进行PCR扩增,通过PCR电泳、测序、荧光定量及质谱等方法对扩增产物进行检测,根据检测结果分析基因组甲基化的情况。
 
服务特
精确度高,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态

主要服务方案
 
1. 亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)
基因甲基化检测

实验原理:
 
用亚硫酸氢盐处理基因组DNA,未发生甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不变。针对要调查的区域设计BSP引物进行PCR扩增,对扩增产物进行测序就可以判断哪些CpG位点发生了甲基化。根据测序方式不同,又分为以下几种:
 
a. BSP直接测序法:对于BSP引物扩增产物直接进行测序;
 
b. BSP克隆测序法:将PCR产物克隆,之后提取质粒进行测序,此方法成功率高、检测方便,适合常规数量样本的特定靶标区域甲基化分析,是国际通用的甲基化分析金标准;
 
c. BSP高通量测序法:可以进行目标片段甲基化水平分析,也可进行全基因组甲基化水平分析。
 
技术特点:准确度高、能给甲基化位点精确定位、可重复性高
 
实验流程:
 
(1)BSP引物设计:针对感兴趣的基因区域进行BSP引物的设计(一般扩增产物不超过300bp)
 
(2)亚硫酸氢盐处理基因组DNA:提取基因组DNA并进行亚硫酸氢盐的转化
 
(3)PCR扩增目的片段:BSP引物扩增感兴趣的区域
 
(4)克隆到载体:将PCR产物纯化后连接到T载体上
 
(5)克隆测序:挑取阳性菌斑,提取质粒并测序
 
(6)序列分析:对测序的结果进行比对和甲基化分析(一般10个克隆子)
 
2. 荧光定量法(Methylight)
 
此方法利用TaqMan 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段,针对甲基化和未甲基化序列各设计一个探针,用不同的荧光标记,随后开展实时定量PCR。如果探针与DNA杂交则释放出荧光信号,根据荧光信号的强度比值计算甲基化水平。
 
技术特点
 
检测通量高。早期由于没有其它高通量的检测方式,用荧光定量法针对较多的样品进行检测时,是一个比较好的检测方案。但是该方法问题比较多,待检测的区域只有一个甲基化位点时,探针的区分度不高。同时,为了达到比较好的区分效果,一般采用MGB探针,探针成本较高。如果只是检测少量样品,探针分摊成本很高。现在针对较多的样品待检测时,通常都会采用高通量测序法,快速、准确,成本可控。
 
以上就是敬善基因为您介绍的关于宫颈甲基化检测时怎么做的,如果您还有什么不明白的地方都可以随时咨询我们!
 
 
 
 
 
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