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基因甲基化检测方法有哪些

来源:敬善基因研究中心 400-188-9770

探究了宫颈细胞变化与基因甲基化的关系过后,我们要做的就是如何检测出基因甲基化的存在现象。随着科学技术的发展,检验技术也在部断提升。大致可以分为两类:特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基化分析,后者也称为甲基化图谱分析(methylation profiling)。下面敬善基因来为大家介绍一些常用的方法。
甲基化检测
 
甲基化特异性PCR(MS-PCR)
 
这种方法经济实用,无需特殊仪器,因此是目前应用最为广泛的方法。在亚硫酸氢盐处理后,即可开展MS-PCR。在传统的MSP方法中,通常设计两对引物,一对MSP引物扩增经亚硫酸氢盐处理后的DNA模板,而另一对扩增未甲基化片段。若第一对引物能扩增出片段,则说明该检测位点存在甲基化,若第二对引物能扩增出片段,则说明该检测位点不存在甲基化。
 
这种方法灵敏度高,可用于石蜡包埋样本,且不受内切酶的限制。不过也存在一定的缺陷,你要预先知道待测片段的DNA序列,并设计出好的引物,这至关重要。另外,若存在亚硫酸氢盐处理不完全的情况,那可能导致假阳性。
 
亚硫酸氢盐处理+测序
 
这种方法一度被认为是DNA甲基化分析的金标准。它的过程如下:经过亚硫酸氢盐处理后,用PCR扩增目的片段,并对PCR产物进行测序,将序列与未经处理的序列进行比较,判断CpG位点是否发生甲基化。这种方法可靠,且精确度高,能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态,但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵。
 
联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)
 
DNA样本经亚硫酸氢盐处理后,利用PCR扩增。扩增产物纯化后用限制性内切酶(BstUI)消化。若其识别序列中的C发生完全甲基化(5mCG5mCG),则PCR扩增后保留为CGCG,BstU I能够识别并进行切割;若待测序列中,C未发生甲基化,则PCR后转变为TGTG,BstUI识别位点丢失,不能进行切割。这样酶切产物再经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。
这种方法相对简单,可快速定量几个已知CpG位点的甲基化,且需要的样本量少。然而,它只能获得特殊酶切位点的甲基化情况,因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能。
 
荧光定量法(Methylight)
 
此种方法利用TaqMan 探针和PCR引物来区分甲基化和未甲基化的DNA。首先用亚硫酸氢盐处理DNA片段,并设计一个能与待测位点互补的探针,随后开展实时定量PCR。这种方法最大的优势在于其高通量和高敏感性,且无需在PCR后电泳、杂交等操作,减少了污染和操作误差。
 
甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析
 
亚硫酸氢盐处理后,甲基化与未甲基化DNA会存在序列差异,这种差异可通过熔解曲线分析来发现,因为甲基化DNA含有更多的GC,相对更难熔解。根据熔解温度及峰型的变化,可轻易区分完全甲基化、完全非甲基化或杂合甲基化。高分辨率熔解(HRM)技术可检出极微小的差别。
 
使用这种方法进行甲基化分析仅需一对引物,相比以往的方法更加快捷、简便和精确。不过对仪器的要求颇高,需要带HRM模块的荧光定量PCR仪。
焦磷酸测序
 
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)作为一种新的序列分析技术,能够快速地检测甲基化的频率,对样品中的甲基化位点进行定性及定量检测,为甲基化研究提供了新的途径。
通过准确定量单个连续的CpG 位点上的甲基化频率,焦磷酸测序本身能检测并定量甲基化水平上的细微改变。在序列延伸过程中,根据C和T的掺入量来定量确定单个位点的C-T 比例。因此,不同位点的甲基化变异就能被准确检测。由于焦磷酸测序提供了真实的序列数据,甲基化状态也就以序列形式呈现。
 
基于芯片的甲基化图谱分析
 
就甲基化图谱分析而言,目前流行的分析方法是芯片。
 
高通量测序
 
新一代测序仪的飞速发展,使得测序成本大幅度下降,也使得甲基化组(methylome)的研究成为可能。近两年,多个研究小组将传统的甲基化工具(如DNA的亚硫酸氢盐转化)与目标基因组捕获技术和高通量测序相结合,绘制出了多张甲基化图谱。
 
而第三代测序技术的出现,更是让甲基化的直接测定成为可能,如单分子实时(SMRT)测序技术。
SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲,依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时,脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息,从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸,包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶
 
 
敬善基因采样亚硫酸氢盐处理+测序方法,仅需微量宫颈脱落细胞既可进行DNA甲基化检测,评估被检测中宫颈癌的风险,帮助更多女性朋友了解自己的健康状态。
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